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细胞培养实验技术汇总(四)

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2016-11-18 细胞之邦

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目录:

第五章 常见组织细胞的培养方法

含 第一节 上皮细胞培养

   第二节 内皮细胞培养

   第三节 神经细胞培养

   第四节 肌组织细胞培养

   第五节 巨噬细胞培养

   第六节 肾小球分离、移植培养

   第七节 裸小鼠移植瘤单细胞分离培养

第六章 肿瘤细胞的培养

含 第一节 组织培养肿瘤细胞生物学特性

   第二节 培养方法

   第三节 成纤维细胞排除法

   第四节 提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施

   第五节 体外培养肿瘤细胞生物学检测

   第六节 对肿瘤细胞系或细胞株的评价


第五章 常见组织细胞的培养方法

体内组织细胞在体外培养时,所需培养环境基本相似,但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同,各自要求条件有一定差别,所采取的培养技术措施亦不尽相同,现介绍个别组织细胞培养的要点如下:

第一节 上皮细胞培养

上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮组织,故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞,培养时生长速度往往超过上皮细胞,并难以纯化,同时上皮细胞难以在体外长期生存,因此纯化和延长生存时间是培养关键。

体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜,因此培养在有胶原的底物上可能利于生长,另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层(用射线照射后)时,细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度,向培养基中加入表皮生长因子,均有利于表皮细胞生长。

以表皮细胞为例,用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞,其法如下(黑木凳志夫 1981)

1、取材:外科植皮或手术残余皮肤小块,早产流产儿皮肤更好,取角化层薄者,切成0.5-1平方厘米小块。

2、置0.02%EDTA中,室温,5分钟。

3、换入0.25%胰蛋白酶中,4℃过夜。

4、分离:取出皮块,用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。

5、取出表皮,剪成更小的块后,置0.25%胰酶中,37℃,30—60分钟。

6、反复吹打,制成悬液。

7、培养:用80目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸去上清。

8、直接加入培养基(Eagle加20%小牛血清)制成细胞悬液,接种入培养瓶,CO2温箱培养。


第二节 内皮细胞培养

内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞,对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子(TAF)等有很大价值。

研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便,其法如下:

1、产后新鲜脐带,无菌剪取10—15厘米长一段,如不能立即培养,可于12小时内保存于4℃。

2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血,在入口处用线绳扎紧,以防液体返流。

3、用血管钳夹紧脐带一端,从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶,充满血管,消化3—10分钟;注入口用线绳扎,以防液体返流。

4、吸出含有内皮细胞的消化液,于离心管中,注入温PBS轻轻反复冲洗后,一并注入离心管中(此步骤可重复)。

5、离心去上清,加入RPMI1640培养液制成细胞悬液,接种入培养器皿中,置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。


第三节 神经细胞培养

神经细胞(神经元)不易培养,只有在适宜情况下,如接种在胶原底层上,或加入神经生长因子和胶质细胞因子时,可出现一定程度的分化,长出突起等现象,但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。

人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养,不仅能获得生长的胶质细胞,也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来,胶质细胞在培养中生长不稳定,不易自发转化,但对外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。

一、设备: 无菌操作设备。

二、大型设备CO2 培养箱:恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。

倒置显微镜:用于每天观察贴壁细胞生长情况。

解剖显微镜,用于准确地取材。

常温冰箱:-4℃,用于保存各种培养液,解剖液和鼠尾胶。

低温冰箱:-20℃--80℃,用于储存血清酶,贵重物品和试剂。

电热干烤箱:用于消毒玻璃器皿。

高压消毒锅:用于消毒培养皿,手术器械。

过滤器:配制解剖液、培养液,必须过滤后才可使用,以去除细菌。

渗透压仪,pH剂,天平等。

三、培养器皿及手术器械

1、培养皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直径。

2、培养板,24-40孔,可用于开放培养。

3、培养瓶:

4、吸管,常用1,5,10ml,均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

5、各类培养液贮存器。

6、小型手术器械。

准备:

1、配制培养液

(1)解剖液:以无机盐(去除Ca2+ , Mg2+)加葡萄糖配制成PBS缓冲液,保持一定的渗透压和pH值。

(2)基础培养基(MEM):主要为多种氨基酸,加入葡萄糖,双蒸馏水溶解。

(3)接种培养液:用于胰酶消化后的细胞分散,做成细胞悬液,其成分为MEM含1%谷氨酰胺,另加入10%马血清,当天配制。

(4)维持培养液:接种后24h,全部换成此液,后每2周换一次,每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清,1%谷氨酰胺,及适量的支持性营养物质。

2、培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶,多聚赖氨酸,再涂胶

3、消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d,达两次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包装,置于烤箱中干燥消毒,于培养前1天进行。

神经细胞分散培养

(一)选材  常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜,小鼠 以18d为宜,大鼠纹状体以10d为宜;若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚,则黑质以13d,纹状体18-21d为宜;小脑以20-21d小鼠胚胎,所获蒲 氏细胞成活率高,颗粒细胞正在分化;脊髓与DRG联合培养,常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神经成活率高。

(二)取材。脑则取出相应组织,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上,用小刀将其要成背腹两侧,分别培养。

(三)细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,移入接种液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用细口吸管吹打细胞悬液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上层细胞悬液,计数,预置细胞密度,接种于培养皿(1×106),做电生理应为5×105或更低。

(四)抑制胶质细胞生长。培养3-5d后,也有人认为培养7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。

(五)观察。接种6-12h,开始贴壁,并有集合现象,细胞生长突起明显,5-7d胶质细胞增生明显,7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面,形成 地毯,2周时神经细胞生长最丰满,四周晕光明显,一个月后,有些神经细胞开始退化,变形,甚至出现空泡,一般培养2-4周最宜。

但神经细胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能传代,不会有细胞周期,而且随培养时间的延长,细胞数量在下降,但胶质细胞可以,神经胶质细胞也可 以。在培养过程中,早期9-12d时,有较多的神经细胞死亡,这是第一次死亡阶段,应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多,且相互 形成突触。

(六)常用培养细胞实验有:FCM的蛋白总量分析;膜片钳与离子通道的分析;免疫组化分析;

但免疫组化分析应注意,由于抗体直接作用于活细胞,不易穿透活细胞,故对核内抗原定位时,首先考虑膜对抗体的通透性问题。常用化学试剂以增加其通透性或采用冰冻方法解决。

在免疫组化中,或其它组织学染色中,常用不同的染色方法以区分不同细胞,如半乳糖脑苷脂对小树突胶质细胞标记明显;GFAP对星形胶质细胞具有特异 性染色等。这对研究神经系统中胶质细胞功能具有极大的应用价值。神经胶质细胞以往多被忽视,其在脑血管疾病(如缺血性损伤)、退行性疾病(如AD、 PD)、损伤后胶质细胞的填充等具有不可忽视的作用。它也是神经细胞功能和营养支持的物质基础。

第四节 肌组织细胞培养

各种肌组织均可用于培养,以心肌和骨骼肌较实用。

(一)骨骼肌细胞培养

1、出生1一2天的乳鼠,引颈处死。

2、无菌取大腿肌组织,切成0.3一0.5cm2小块后,用不含钙镁离子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,无菌纱网或纱布滤过。

3、计数调整细胞密度。

4、快接种量2×106/皿入培养基培养。

5、培养基内含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促进分化。

接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化,明胶配置:用Hanks液配成0.01%明胶。

该细胞接种率约50%,细胞生长开始呈纺锤形,培养50-52小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止,此时可观察到横纹,一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。

(二)心肌细胞培养

心肌细胞是最早的培养材料,Carrel曾长期培养过心肌组织,至今心肌仍不失为好的培养物,最常用的是鸡胚心肌。

心肌比较容易培养和生长,可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法,均可获良好的效果。取心室肌培养较好,原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形,培养成功时,一周后可见节律性收缩现象。

第五节 巨噬细胞培养

巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活2-3周,多用做原代培养,难以长期生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系,大多来自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均获恶性,培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难以建株。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞,以小鼠腹腔取材法最为实用,其法如下:

1、实验前三天,向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml(勿注入肠内!),以刺流产生大量的巨噬细胞。

2、引颈处死小鼠。

3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3-5秒。

4、置动物于解剖台,用针头固定四肢,持镊撕开腹部皮肤,但勿伤及腹膜壁,把皮肤拉向上下两侧,暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同时用手指从两侧压揉腹膜壁,使液体在腹腔内流动。

6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧.使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。

7、小心拔出针头,把液体注入离心管。

8、4℃下250g离心10分钟后,去上清,加10ml Eagle培养基。

9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞,其中90%为巨噬细胞。

10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。

11、接种数小时后,除去培养液,可去除其它白细胞,纯化培养细胞,用Eagle液冲洗1一2次,再加新Eagle培养液置CO2温箱中。

第六节 肾小球分离、移植培养

SD大鼠颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡1~2分钟,2次,置超净台内,打开腹腔取出肾脏剪碎,置含Hank's液的无菌培养皿洗涤,置80目不锈 钢筛网上。用扁平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网,滤过组织Hank's液混合物用吸管吸至120目不锈钢筛网,滤过,去小组织块,滤过物吸至 200目不锈钢筛网,轻轻滤过,Hank's液洗涤1次,收集网上肾小球,镜下观察为分离良好的肾小球。

肾小球用0.2%胰酶、0.1%胶原酶,37℃消化20分钟,加血清终止胰酶反应,离心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至24孔培养板或25ml培养瓶,使肾小球大于60个/cm2, 加培养基5~10ml(培养基组成:F12—3T3上清1:1;5%马血清;2.5%胎牛血清;胰岛素5μg/ml;25ng/ml氢化可的松;5μg /ml转铁蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲状腺素0.02ng/ml;D-缬氨酸150ng/ml)肾小球培养8~10天,去除肾小球未生长组分, 细胞继续培养24小时,形态学观察:细胞生长成单层多角型细胞,直径约100μm。

第七节 裸小鼠移植瘤单细胞分离培养

无菌条件下取出小鼠移植瘤组织,剪成1mm3小块,用0.5%胶原酶室温消化30分钟到1小时,再加等体积0.2%胰酶消化5~8分钟,在消化过程 中用吸管吹打组织块或用自制装置(分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接而成,滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞)来回推动注射 器吹打组织以分离单细胞,终止酶消化方法同上。

常规方法接种培养收获细胞。

第六章 肿瘤细胞的培养

肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置,首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。

第一节 组织培养肿瘤细胞生物学特性

肿瘤细胞与体内正常细胞相比,不论在体内或在体外,在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞,其差异较小,但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点:

(一)形态和性状

培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态,大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰,核膜、核仁轮廓明显,核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密,微丝走行不如正常细胞规则,可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。

(二)生长增殖

肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性,在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖,是因血清中含有很细胞增殖生长的因子,而癌细 胞在低血清中(2%~5%)仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后,出现能在低血清培养基中生长的现象,已成为 检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时,形成集落(克隆)的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时,接触抑制 消除,细胞能相互重叠向三维空间发展,形成堆积物。

(三)永生性

永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡(Apoptosis)。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状,体内肿瘤 细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽,从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此?也尚难 肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明,如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的,肿瘤细胞应易于培养。事实上,多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖 并不旺盛;经过纯化成单一化瘤细胞后,也大多增殖若干代后,便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性,顺利传代生长下去。从而说明体 外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系,如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等细胞证明,永生性和恶性 (包括浸润性)是两种性状,受不同基因调控,但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。

(四)浸润性

浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为,培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时,能浸润入其它组织细胞中,并有穿透人工隔膜生长的能力。

(五)异质性

所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织;处于瘤体周边区的细胞获 得血液供应多,增殖旺盛,中心区有的细胞衰老退化,有的处于周期阻滞状态,那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞(Stem  Cells)、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖;把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。

(六)细胞遗传

大多数肿瘤细胞有遗传学改变,如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成,有干细胞系和数个亚系,并不断进行着适应性演变。

(七)其它

肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于:

①依赖性:肿瘤细胞虽有较强克隆生长力,但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存,二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系,可能影响癌细胞增殖生长的活性;

②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释,达不到肿瘤生长的需求,降低肿瘤细胞的生长增殖力;

③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span,只有干细胞才有强的增殖生长能力,但这些细胞数量很少;

④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。

有细胞增殖,传若干代后停止生长或衰退死亡;

传数代后细胞增殖缓慢,经过一段停滞期后,才又呈旺盛生长状态,形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。

以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求,并需经过对新环境的适应才能生长,因此欲获得好的培养效果,不能局限于一般培养法,必须采用一些特殊的措施。

1、适宜底物:把经过纯化的细胞接种在不同的底物上,如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。

2、生长因子:应用促细胞生长因子,向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物,常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。

为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞(干细胞)的数量,可采用动物体转嫁接种成瘤后,再从动物体内取出进行培养,能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。

3、动物体媒介培养方法:

(1)瘤块接种:取新鲜瘤组织,用Hanks液洗净血污,切成1~3毫米小块,用穿刺针头吸一小瘤块,用酒精棉球擦拭动物腹部后,直接刺入皮下,注入瘤块;

(2)饲养观察,待肿瘤生长达较大体积后,剥取出瘤组织;

(3)进行体外培养。

(4)为防止失败,仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种,有活力的肿瘤细胞数量增多,细胞培养易于成功。

肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同,但成功率比正常细胞高。


第二节 培养方法

肿瘤细胞培养成功关键在于:取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面,肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别,初代培养应用组织块和消化培养法均可。

1、取材:

人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要,体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区,取材时尽量避免用退变组织,要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养,如因故不能立即培养,可贮存于4℃中,但不宜栽过24小时。

2、培养基:

肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格,一般常用的 RPMIl640、  DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低,正常细胞培养不加血清不能生长,肿瘤细胞在低血清培养基 中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine)性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。 按不同细胞需要不同的生长因子;肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。 有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等)。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。

3、成纤维细胞的排除:

成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长,致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快,最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法(表2-1)。

表2-1 抑制成纤维细胞生长因素
表2-1 抑制成纤维细胞生长因素


注:上表结果为个别实验室经验,仅供参考

第三节 成纤维细胞排除法

1、机械刮除法:

是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝)、或裹少许脱脂棉制成,装入试管中高压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为:

(1)标记:镜下观察,用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位;

(2)刮除:弃掉培养液,把无菌胶刮伸入瓶皿中,肉眼或显微镜窥视下,刮除无标记空间;

(3)用Hanks液冲洗一两次,洗除被刮掉的细胞;

(4)注入培养液继续培养,如发现仍有成纤维细胞残留,可重复刮除至完全除掉为止

2、反复贴壁法:

根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点,并结合使用不加血清的营养液,把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁,使两类细胞相互分离,操作方法与传代相同。

(1)待细胞生长达一定数量后,倒出旧培养液,用胰酶消化后,Hanks 冲洗2次,加入不含血清的培养液,吹打制成细胞悬液;

(2)取编号为此A、B、C三个培养瓶;首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5~20分钟后,轻轻倾斜培养瓶,让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液,再接种入B培养瓶中后;向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养;

(3)培养B瓶中细胞5~20分钟后,接处理A的方法,把培养液注入C培养瓶中;再向B瓶中补加完全培养基。

当三个瓶内都含有培养液后,均在温箱中继续培养。如操作成功,次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞,B瓶两类细胞相杂,C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次,直至癌细胞纯化为止。

3、消化排除法:

此法曾用于乳癌细胞的培养,具体程序是:

(1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次,然后再换成新的混合液继续消化,并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶,到半数细胞脱落下来后,便立即停止消化;

(2)把消化液吸入离心管中,离心去上清,吸入另瓶中,加培养液置温箱中培养;向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后,成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理,可能把成纤维细胞除净。

4、胶原酶消化法:

本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点,通过消化进行选择。

(1)可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理,边消化边在倒置显微镜下窥视,当发现成纤维细胞被除掉后,即终止消化;

(2)用Hanks洗涤处理一次后,更换新培养液,继续培养,可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净,可再次重复。

5、其它方法:

有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用;也有人用聚蔗糖制备成比重1.025~1.085的密度梯度离心液,加入细胞悬液后,在23℃中 800g离心  10分种。在比重1.025~1.050层为成纤维细胞,在比重1.050~1.085层为上皮细胞,再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如 SOD抑制成纤维细胞生长的方法。

选用上述任何一种方法,都需进行试验,取得必要经验,找出适合的条件,才能获得好的效果。

第四节 提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施

根据人们的经验,肿瘤细胞在体外不易培养,建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后,常出现以下几种情况:

完全无细胞游出或移动;

有细胞移动和游出,但无细胞增殖,细胞长时间处于停滞状态以致难以传代;

第五节 体外培养肿瘤细胞生物学检测

一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系(或株)后,不论用于实验研究还是建立细胞系,都需要做一系列的细胞生物学测定,主要的目的在于求得证明:

所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞,而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。阐明一般生物学性状。测定项目数量无明确规定,根据需要而定,以下为常做的项目和要点。

【形态观察】主要观察细胞的一般形态,如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。

【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。

【细胞核型分析】检测核型特点,染色体数量、标记染色体的有无、带型等。

【凝集试验】检测凝集力。

【软琼脂培养】检测集落形成能力。

【异体动物接种】向异体动物体内(皮下)接种细胞悬液,观察成瘤能力。

【其它】除上述项目外,根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析,荧光显微镜观察等。

在上述肿瘤细胞生物学检测中,最主要的为:异体动物(以用裸鼠为上)接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抗癌基因等的检测,这些项目将在本书第二篇中介绍。

第六节 对肿瘤细胞系或细胞株的评价

已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株,无疑都是可用的实验对象。近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多,并获得越来越广泛的应用。但根据研究者的经验,在 使用这些细胞系时,应持特别审慎态度,主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。众所周知,长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。 另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变动。以近年建成的各种肿瘤细胞系为例,都已传代少则几十,多则 百代以上后,才确认建成了细胞系。这种情况下很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。

已如前述,癌细胞在培养中并非能很顺利地传下去,凡已长期传代的细胞系,都已获得不死性。当前尚未完全确证所有癌细胞都具有不死性;因此尚难肯定在 长期培养中的癌细胞的生物学性状与体内时仍完全相同(包括不死性)。据上述对用癌细胞系所获实验结果应尽量做分析性的结论,避免做概括性的与体内等同的结 论,外推与体内等同更是不妥的。广泛来说,应用各种较长时间培养细胞做实验时,都应如此。

文章来源:丁香通、网络


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